故障排除

以下故障排除指南旨在解釋蛋白質印跡中觀察到的常見問題的原因和可能的解決方案。

Simple Western™ 可以克服傳統蛋白質印跡法中需要排除故障的許多挑戰，它可以在臺式儀器內自動執行蛋白質印跡法的傳統步驟。 Simple Western 使用毛細管電泳，消除了傳統蛋白質印跡的凝膠到印跡轉移，提供定量和可重復的結果。了解有關Bio-Techne 品牌 ProteinSimple 的Simple Western 儀器的更多信息。

無信號或信號弱

一抗濃度太低

• 增加一抗的濃度（滴定可能有幫助）。Novus 抗體濃度試劑盒可用于增加一抗濃度。

• 將孵育時間延長至 4°C 過夜

• 如果一抗重復使用次數過多，則有效抗體濃度可能太低；使用新鮮抗體來改善信號

目標蛋白濃度太低

• 每孔加載更多蛋白質（滴定可能有幫助）

• 使用已知表達目標蛋白的陽性對照裂解物、過表達裂解物或重組蛋白

• 確保裂解緩沖液是目標蛋白的最佳緩沖液；裂解緩沖液根據靶蛋白定位而有所不同。

• 如果需要增加非豐度蛋白質的濃度，請使用免疫沉淀或分級分離（即核分級分離）

• 在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑

• 確保樣品未降解

蛋白質從凝膠到膜的轉移不成功

• 通過膜的麗春紅染色或凝膠的考馬斯染色確認蛋白質已成功轉移到膜上。

• 通過分析加載控制表達式確認等量轉移

一抗和二抗不兼容

• 確保二抗是針對產生一抗的物種而產生的

• （例如，如果一抗是在小鼠中產生的，則使用抗小鼠二抗）

膜選擇不理想

• 檢查抗原序列的疏水性/親水性。 PVDF 膜可能更適合親水性/極性/帶電抗原，而硝酸纖維素膜可能更適合疏水性/非極性抗原

存在阻塞問題

• 封閉時間過長會掩蓋某些表位并抑制抗體結合；減少封閉孵育時間或封閉液濃度

• 切換到不同的阻塞解決方案

膜沖洗過度

• 隨著時間的推移，檢測試劑可能會變得不活躍。確保試劑新鮮。二抗可以通過將其點在膜上并與檢測試劑一起孵育印跡來進行測試。

• 處理低豐度蛋白質時，使用更靈敏的試劑（滴定可能有幫助；如果稀釋，請使用高純水）

圖像曝光時間太短

• 增加曝光時間（多次檢查以達到最佳曝光時間）

抗體僅識別天然蛋白質

• 如果使用僅識別天然蛋白質的抗體，請勿使用還原的變性蛋白質

目標是低分子量

• 減少傳輸時間以防止過度傳輸。對于小蛋白質以及孔徑較小的膜（0.2 μm 與 0.45 μm），建議使用濕轉法

發生疊氮hua鈉污染

• 疊氮hua鈉（通常用于儲存一抗）會抑制 HRP 活性。確保充分洗滌以去除疊氮hua鈉的存在或使用不含疊氮hua鈉的緩沖液。

高均勻背景

阻擋不足

• 增加封閉時間和/或溫度

• 增加封閉劑的濃度（嘗試達到10%）

• 考慮更換封閉劑（牛奶與 BSA）

• 在抗體緩沖液中加入可選的封閉劑（也可以增加百分比）

阻止不兼容

• 對于磷酸化蛋白質的檢測，不建議使用牛奶（牛奶和酪蛋白富含磷酸化蛋白質）

由于高抗體濃度導致非特異性結合

• 降低初級或次級的濃度（滴定可能有幫助）

• 在抗體緩沖液中加入封閉劑

• 通過執行二抗對照來確認二抗的特異性：省略一抗，僅將印跡與二抗一起孵育。

未結合的抗體洗滌不充分

• 增加洗滌次數和/或時間

干膜

• 確保在蛋白質印跡實驗過程中膜永遠不會變干

膠片曝光時間太長

• 降低曝光時間（可能需要測試一系列曝光時間）

檢測試劑過于敏感

• 用純水稀釋檢測試劑或使用靈敏度較低的檢測試劑

非特定條帶/尺寸錯誤或多條帶

目標蛋白豐度低于非特異性結合閾值

• 在 SDS-PAGE 凝膠中加載更多蛋白質

• 通過免疫沉淀或分級分離富集低豐度蛋白質

樣品降解

• 使用新鮮裂解物

• 將樣品放在冰上，直到樣品緩沖液添加和沸騰之前

• 如果檢測磷酸化靶標，則始終包含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑

可能存在其他蛋白質亞型

• 可能存在選擇性剪接或多聚體形成。在這種情況下，可能需要異構體特異性抗體。

可能存在翻譯后修飾

• 預測的分子量可能受到許多因素的影響，例如糖基化、磷酸化和蛋白質加工（從前體形式裂解為成熟形式）。為了確認特異性，進行陽性和陰性對照，例如重組蛋白或過表達裂解物、下調的敲低/敲除裂解物

有斑點或漩渦的背景

膜處理不當

• 盡量減少與膜的接觸。使用干凈的工具處理膜

緩沖液污染

• 制作新鮮的緩沖液

氣泡

• 轉移前滾平凝膠和膜之間的所有氣泡

HRP聚合

• 使用 0.2 μm 過濾器過濾二抗以去除聚集物

洗滌不足

• 增加洗滌緩沖液的體積

• 增加洗滌次數和/或持續時間

其他事宜

白色/空心帶

• ECL 底物消耗太快。降低一抗/二抗濃度或減少蛋白質用量

條帶/泳道涂污（樣品超載）

• 每個泳道中加載較少的蛋白質

分子量標記泳道為黑色

• 抗體可能與分子量標記發生反應

• 在分子量標記和第一個樣品泳道之間添加空白泳道