當(dāng)PH值為7-9時，不需要偶聯(lián)劑，PEG胺能與NHS酯有效反應(yīng)。

(1)將含有小分子的胺緩慢溶解在有機溶劑中，如DMF、CH2Cl2、DMSO、THF或其他溶劑。
(2)根據(jù)反應(yīng)動力學(xué)，在連續(xù)攪拌下將含NHS的化合物以1:1或2:1當(dāng)量mmol添加到反應(yīng)混合物中。
(3)根據(jù)底物的性質(zhì)攪拌反應(yīng)混合物3-24小時，并通過LC-MS或TLC板監(jiān)測。
(4)最終產(chǎn)物可以通過常規(guī)的有機合成或柱純化來分離。

比例1:1當(dāng)量
偶聯(lián)劑可以是EDC、DCC、HATU。 EDC 交聯(lián)在酸性 (pH 4.5) 條件下很有效。
(1)開瓶前將EDC和羧酸保持至室溫。
(2) 將 100mg 每種試劑（約 100μL）溶解在所需量的可與水混溶的無水溶劑（如 DMF 或 DMSO）中，制備羧酸儲備溶液。
(3)將適量的EDC和含胺分子加入適量的活化緩沖液中的羧化表面，并在室溫下反應(yīng)15分鐘。
(4)加入DTT猝滅EDC。注意：對于易于清潔的表面，可以跳過淬火步驟，并用偶聯(lián)緩沖液清洗表面，以去除任何殘留的 EDC 和 NHS。
(5)將綴合物緩沖液中制備的羧酸混合物添加至活化的表面并在室溫下反應(yīng)2小時。
(6) 加入羥胺或另一種含胺緩沖液以猝滅反應(yīng)。羥胺水解固體表面上未反應(yīng)的 NHS 并形成羥基鹽。其他猝滅方法包括添加三聚氰胺、賴氨酸、甘氨酸或乙醇胺；然而，這些含伯胺的化合物可以修飾羧基。 （注：新引入的羧基可以通過重復(fù)步驟4和5進一步修飾）
(7) 將偶聯(lián)緩沖液中制備的所需含胺底物添加到活化的表面，并在室溫下反應(yīng)2小時。
(8) 按照步驟7所述猝滅反應(yīng)。